Прионы – белки в аномальной третичной форме, инфекционные агенты. Они способны катализировать конформационное превращение неприонных молекул белка, что приводит к появлению амилоидных агрегатов. Разрушить или остановить полимеризацию прионных белков очень сложно, так как они обладают повышенной стабильностью. С прионогенезом связано множество неизлечимых смертельных болезней, так как прионы млекопитающих приводят к гибели нервных клеток. Путь образования и поведения прионных форм, механизм действия, схожи с аналогичными процессами бета-амилоидов, что позволяет применять знания, полученные при исследовании прионов к другим серьезным болезням, таким как болезнь Альцгеймера. Прионные белки так же найдены у некоторых грибов, что позволяет моделировать свойства прионов и амилоидов млекопитающих на более простых генетических моделях.
В нашей работе мы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae, у которых обнаружен целый ряд белков с прионными свойствами. Неменделевски наследуемый детерминант [PSI+], прионная изоформа белка Sup35. Прионизация eRF3 приводит к его частичной инактивации, что ведет к появлению нонсенс-супрессии. Для оценки ее эффективности используют штаммы, несущие различные нонсенс-мутации, например мутацию аde1-14. Клетки [PSI+] образуют белые колонии на полной среде. Если белок Sup35 имеет неприонную конформацию, нонсенс-супрессии не происходит. Клетки [psi-]не растут на среде без аденина, на полной среде образуют красные колонии.
Белок Sup35состо ит из трёх функциональных доменов: N, M , C. N-домен имеет участки, необходимые для прионизации и для взаимодействия молекул Sup35 между собой в процессе прионизации. Одним из подходов к изучению роли разных доменов Sup35 в индукции и поддержании [PSI+] стало создание химерных конструкций, объединяющих прионизующий пептид – N- (NM-) домен белка Sup35 с белками-репортерами. Наличие в клетке гибридного белка Sup35NM-Ade2 приводит к нонсенс-супрессии, которая связана с возникновением [PSI+]-подобного фактора (вероятнее всего, за счет полимерной структуры белка).
В нашей лаборатории была получена конструкция, в которой белок Ade2 был слит с N-доменом белка Sup35. Эффективность прионизации химерно белка N-Ade2 была снижена, предположительно, из-за отсутствия линкерного М-домена. Данные по объединению в одном белке NM-домена белка Sup35 и мономерного белка Ade1 показали, что в этом случае эффективной прионизации не происходит.
Данная работа посвящена изучению влияния олигомеризации неприонного домена на формирование прионных агрегатов с использованием химерных белков, у которых к N- или NM- домену белка Sup35 пришит олигомеризующийся белок Ade2 или мономерный белок Ade1
На первом этапе мы амплифицировали промотор гена SUP35 и фрагмент гена SUP35, кодирующий N-домен соответствующего белка, с помощью праймеров. Для изучения влияния экспрессии химерного гена N-ADE1 на эффективность нонсенс супрессии мы трансформировали штаммы плазмидами pNM-ADE2, pN-ADE2, pNM-ADE1 и pN-ADE1. В качестве контрольной плазмиды мы использовали базовый вектор pFL38. Трансформантов отбирали на селективной среду С-Ura,Ade для оценки эффективности супрессии нонсенс-мутации ade1-14 или на селективную среду селективной среду С-Ura,Trp для оценки эффективности супрессии нонсенс-мутации trp1-289.
Трансформанты [PIN+] плазмидами pNM-ADE2 и pN-ADE2 эффективно супрессировали нонсенс-мутацию ade1-14. При этом у трансформантов [pin-] этими же плазмидами нонсенс-супрессии зафиксировано не было. Трансформанты [PIN+] и [pin-] плазмидами pNM-ADE1 и pN-ADE1 не супрессировали нонсенс-мутацию trp1-289. Мы не могли оценить супрессию мутации ade1-14 у этих трансформантов, поскольку химерные гены NM-ADE1 и N-ADE1 компенсируют эту мутацию.
Полученные нами данные можно объяснить тем, что для эффективной прионизации химерных белков необходимо, чтобы происходило сближение их N-доменов. Это чаще всего происходит при мультимеризации химерных белков. Белок Ade1 является мономером, поэтому химерные белки NM-Ade1 и N-Ade1 не обладают способностью к спонтанной прионизации и не могут инициировать прионизацию белка Sup35.
