Метилирование является одним из важных механизмов модификации ДНК. Метилирование ДНК— модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК, что можно рассматривать как часть эпигенетической составляющей генома. [Bethany et.al, 2013]. Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к цитозину в составе CpG-динуклеотида в позиции С5 цитозинового кольца.
У бактерий имеются два типа ферментов, метилирующих ДНК: dam- и dcm-. Dam- осуществляет перенос метильных групп в N-положение аденина в нуклеотидной последовательности ГАТЦ, Dcm-метилирует остатки цитозина в положении С5 в последовательностях ЦЦАГГ и ЦЦТГГ. В результате метилирования соответствующие сайты становятся устойчивыми к рестрикции. ДНК-метилазы бактериальных систем рестрикции и модификации применяют для блокирования invitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения рестрикционных фрагментов больших размеров. Для предотвращения влияния ДНК-метилаз на клонируемые ДНК в качестве клеток-хозяев используют мутантные штаммы E. coli (dam— и dcm—).
Ферменты рестрикции широко используются в качестве метода модификации ДНК в современной молекулярной биологии. Рестрикция—это процесс разрезания молекулы ДНК специфическими эндонуклеазами рестрикции.Все рестриктазы разрезают фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами в ДНК.Рестриктные фрагменты(фрагменты ДНК,образовавшиеся в ходе рестрикции)имеют фосфатную группу на 5’-конце и гидроксильную группу на 3’-конце.Каждая рестриктаза имеет свой специфический сайт узнавания.Все рестриктазы делятся на несколько групп.Рестриктазы из разных групп различаются сайтами узнавания,местом разрезания относительно сайта узнавания и структурой молекул фермента.
Рестрикция блокируется при распознавании последовательности метилированых родственных метилаз.Метилирование на других основаниях может блокировать расщепление,оставить без изменений или замедлить скорость и степень расщепления.
DAM+иDCM+ штаммы Escherichia coli блокируют блокируют рестрикцию некоторых рестриктаз, сайты узнавания которых совпадают с сайтами модификации DAM+ и DCM+- метилаз.[Geier GE, Modrich P, 79]. Несмотря на устоявшееся мнение в данном вопросе, мы решили проверить их достоверность. Целью нашей работы была оценка влияния Dam и Dcmметилаз на ферменты рестрикции, сайты узнавания которых совпадают с сайтами модификации этих метилаз. В ходе работы были использованы Dam+,Dcm+,Dam-,Dcm- штаммы E. coli. Эти штаммы были трансформированы с помощью плазмид, содержащих сайты рестрикции, перекрывающиеся с сайтами узнавания Dam, Dcm-метилаз. Dam-,Dcm- штаммы E. coli были использованы в качестве контроля для проверки работоспособности используемых ферментов рестрикции. После получения достоверного контроля Dam+,Dcm+ штаммы модифицировали соответствующими плазмидами, после чего плазмидную ДНК выделяли и производили попытку произвести рестрикцию с помощью соответствующих эндонуклеаз рестрикции. Продукты реакции анализировали с помощью горизонтального гель-электрофореза в агарозном геле.